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三七总皂苷对阿霉素致心肌损伤保护作用的研究

三七总皂苷在体内和体外均显示减轻阿霉素心脏毒性的作用同时并不影响后者抑制肿瘤细胞生长的作用阿霉素显著升高小鼠血清心肌酶指标降低心肌组织抗氧化酶活力不同剂量三七总皂苷均能减轻心肌损伤

阿霉素抗肿瘤药物

阿霉素 ( doxorubicin) 属于葱酿类抗生素,是一种高效、广谱的抗肿瘤药物,临床上常用于治疗多种恶性肿瘤。然而,阿霉素具有明显的剂量依赖性心脏毒副作用,可引起急性、慢性及迟发性心脏毒性,且一旦出现充血性心力衰竭,其致死率可达30%-50%,因而其临床应用受到严重限制

阿霉素的心脏毒性机制尚未完全阐明,但一般认为与体内形成大量自由基及脂质过氧化有关,并引起心肌细胞能量代谢紊乱,导致心脏功能受损

三七为五加科人参属植物三七Panaxn otoginseng(Bu rk.)F.H .Chen的干燥根,是我国特产的药材。传统医学中认为其具有散痕止痛、消肿活血的功效。近年来临床研究中发现,三七对于多种原因造成的心肌损伤有保护作用,其活性成分三七皂苷(Pa naxr notoginsengsaponins, PNS),在缺血性心脏病的治疗中得到成功应用,其作用机制可能与提高心肌细胞抗氧化能力,改善细胞能量代谢有关。由于 缺 血 性心脏病和阿霉素致心肌疾病都与细胞能量代谢紊乱有关,笔者推测三七皂苷可能对阿霉素致心脏损伤具有保护作用。本研究采用阿霉素急性心脏毒性模型和离体培养的心肌细胞分别评价
三七皂苷的保护作用,同时观察了三七皂苷对阿霉素抗肿瘤活性的影响,为进一步扩大三七的临床应用提供依据


三七皂苷对阿霉素致心肌损伤保护作用实验准备

药物和试剂三七药材购自云南文山,由浙江大学药学院贺庆副教授鉴定,样品保存于浙江大学中药系。三七皂苷(PNS )由本实验室提取。经HPLC分析,PNS中人参皂苷Rb,,R g ,,R d ,Re 和三七皂苷R:的总含量约91%.盐酸多柔比星注射液,浙江海正药业股份有限公司生产,批号060904。乳酸脱氢酶(lactated ehydrogenase,LD H)试剂盒(批号06060101)、肌酸激酶(cr eatinek inase, CK )试剂盒(批号07010101)、肌酸激酶同工酶(mbisoenzyme ofcreatinek inase, CK MB)试剂盒(批号06080101)均购于宁波亚太生物技术公司。过氧化氢酶(catalase,CAT)试剂盒(批号20070302)、超氧化物歧化酶( superoxide dismutase , SOD)试剂盒(批号20070302)、谷胧苷肤(glutathionep eroxidase,G SHPx)试剂盒(批号20061220)均购于南京建成生物工程研究所。DMEM完全培养基(批号1384657),胎牛血清(批号613864)为Gibe。公司产品。超级新生牛血清(批号20070415)为SeRaBio公司产品。
1.2 动物及细胞清洁级ICR小鼠,雄性,体重(20 t2) g,由浙江省实验动物中心提供,合格证号:CSXK2003-0001。大鼠心肌细胞H9CZ 、人红白血病细胞K562、人口腔上皮癌细胞KB、人乳腺癌细胞MCF一由中国科学院上海细胞所细胞库提供

三七皂苷对阿霉素致心肌损伤保护作用实验方法

2.1 动物分组、给药及造模40只小鼠随机分为5组,每组8只,分别为:正常对照组,阿霉素模型组,3个剂量的PNS干预组(25,50,100 mg·kg-')。给药及造模方案:正常对照组以0.02mL"g-’每日灌胃给予生理盐水,在第5天腹腔注射等量生理盐水代替阿霉素;阿霉素模型组每日灌胃给予等量的生理盐水,第5天腹腔注射15 mg·kg一’盐酸阿霉素;PNS干预组造模前按0.02mL"g-’体积每日灌胃给予不同剂量的药物,连续5d,每天1次,第5天给药1h内腹腔注射15 mg·kg一’盐酸阿霉素,此后继续给药2d。动物在检测前禁食12 h,不禁水。
2.2 动物血清及组织指标的测定造模后72 h,戊巴比妥麻醉动物,腹腔静脉取血;解剖取心脏,称重,加pH7 .4, 0. 01 m ol·L一’Tirs-HCI溶液,制成5%匀浆。血清样品中LDH,CK,CKMB活力使用相应试剂盒按说明书方法测定。5%组织匀浆使用考马斯亮蓝法确定其中蛋白含量,使用相应试剂盒按说明书方法测定SOD,CA T,GS H-PX的活性
2.3 心肌细胞培养及给药培养H9C Z细胞(37℃,饱和湿度,95%空气+5% C02,含10% FBS的DMEM培养基)至状态稳定,接种于%孔板上,每孔细胞量约为1 x 104个。24 h后更换培养液,加入不同质量浓度(0,6.25,12.5,25,50,100 mg·L-1)的PNS,1 h后,加入10 pmol·L一’阿霉素或相等量的溶剂。其

中,不含阿霉素和PNS的处理组作为正常对照组;仅含阿霉素,不含PNS的处理组作为模型组。培养24h后,用MT 法在波长550 nm处测定吸光度值(A)表示细胞活力。细胞的相对活力按以下公式计算:细胞相对活力(%)二PNS组(A)/正常对照组(A) x 100%
2.4 肿瘤细胞培养及给药为了评价PNS对阿霉素抗肿瘤活性的影响,采用三株人源肿瘤细胞,即MCF-7, KB及K562进行实验。分别培养MCF-7,KB,K5 62细胞(37℃,饱和湿度,95%空气+5%C02,含10%超级新生牛血清的DMEM培养基)至状态稳定,接种于%孔板上,每孔细胞量2x10,个。
24 h后更换其培养液,加人不同质量浓度(0,6.2512.5,25,50,100 mg·L一’)的PNS,1 h后,加人0.1N,mol·L-’阿霉素。其中,不含阿霉素和PNS的处理组作为正常对照组;仅含阿霉素,不含PNS的处理组作为阿霉素干预组;同时含有PNS和阿霉素的处理组为联合干预组。各组含有等量的溶剂DMSO
(0.1%)。细胞培养48 h后,用MT 法在波长550nm处测定A。细胞生长抑制率按照以下公式计算:
细胞生长抑制率(%)二(正常对照组A一药物处理组A)/正常对照组Ax100%
2.5 统计处理实验数据采用SPSS1 1.0 软件进
行分析,实验结果用it。表示,组间比较用Dunnettt检验。P< 0.05 为显著性差异。


三七皂苷对阿霉素致心肌损伤保护作用结果

3.1 对阿霉素致小鼠急性心肌损伤的影响动物实验中模型组心肌酶谱各项指标均大幅上升,与正常对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。而PNS干预组(25,50,10 0m g" kg -')与模型组相比,各指标均明显下降。中、高剂量组(50,100m g·kg-I)LDH,CK,CKMB与模型组相比均具有显著性差异(P<0.05)或非常显著差异(P<0.01),下降幅度分别达到32.5%, 41.8%, 29.4%及44.2%,39.5%,36.0%。说明PNS能减轻阿霉素对心肌组织的损伤心肌组织的SOD,CA T,GS H-PX的活性反映组织对抗氧应激的能力。模型组各种抗氧化酶的水平均较对照组显著降低(P<。.05)。PNS干预组(25,50,100 mg " kg-')与模型组相比,酶的活力有所增高,且显示一定的剂量依赖关系。其中,中、高剂量组(50,100 mg " kg-')各项酶活水平与模型组相比均存在显著性差异(P<0.05),升高幅度分别为16.9%,28.4%,21.1%及17.6%,32.1%,17.0%
说明PNS能抑制阿霉素降低抗氧化酶活力的作用,能增强组织对抗氧化损伤的能力

3.2 对阿霉素心肌细胞毒性的影响MT 法是利用细胞线粒体呼吸代谢产生紫色甲脱的量来间接反映细胞活力和数量的方法。在本研究中,模型组心肌细胞H9C2 经过10N ,mol·L一‘的阿霉素处理24h后,细胞活力较对照组下降了20%左右。在加阿霉素之前1h给予不同质量浓度的PNS( 6.25 一100mg·L-1),显示一定的保护效果,细胞活力有所升高。同时,PNS对照组显示,药物本身在此剂量范围内对细胞活力并无明显影响,只在100 mg·L-’显示微弱的抑制作用

3.3 对阿霉素抑制肿瘤细胞生长的影响阿霉素在0.1 W mol·L一’浓度下,对MCF-7,KB及K5623种细胞的抑制率分别为32.0%,36.2%和45.7%.提前1h加入不同质量浓度(6.25一100 mg·L-1)的PNS,对上述细胞的抑制率分别在38.6% -44.1%,31.6%一40.6%,46.3%一56.1%,并未降低阿霉素对肿瘤细胞的抑制作用,但亦未显示明显的协同增效作用


三七皂苷对阿霉素致心肌损伤保护作用讨论

本研究通过整体动物实验证明,PNS对于阿霉素引起的心肌损伤具有明显的预防和缓解效果,能够维持组织抗氧化酶活力水平。其保护作用在25一100 mg " kg-’的剂量范围内,显示一定的剂量相关性,即随给药剂量的增加,反映心肌损伤的血清LDH,CK -MB等指标相应降低,而反映组织抗损

伤能力的SOD,CA T等指标相应升高。PNS抗阿霉素心脏毒性的作用,通过进一步的离体培养细胞实验获得验证,说明PNS对心肌细胞具有直接保护作用。但是从实验结果来看,PNS对细胞活力提高的幅度并不大,且未显示明显的剂量依赖关系。笔者推测PNS对心肌细胞的保护作用可能还有其他间接途径,或PNS某些代谢产物具有更强的心肌保护活性,但需要进一步的研究加以证实。实验结果同时说明,PNS对阿霉素抑制肿瘤细胞生长的作用没有影响,但也不存在协同增效作用。
目前公认有效的抗阿霉素心脏毒性的药物还不多,而口服有效的药物基本没有。右雷佐生(de xrazoxane)是 被FDA唯一批准临床应用的心脏保护剂,需要通过静脉注射给药。且该药物尚未在国内批准上市,因此,很难获得合适的阳性对照药物。在本研究中,并未采用阳性对照药物,是本试验设计的不足之处。但本研究提供的实验结果,仍能充分地证明PNS对于防治阿霉素心脏毒性的潜在价值。
阿霉素引起细胞损伤甚至死亡,会导致血清LDH,CK及CKMB水平显著升高,一般认为CK和CKMB能够较为特异性地反映心肌细胞的损伤通过测定血清心肌酶谱指标,可以判断阿霉素引起的细胞损伤程度以及药物的保护作用。本研究显示,阿霉素损伤后,血清LDH,CK及CKMB变化趋势基本一致,说明阿霉素主要的毒性靶器官是心脏。
当前 对 阿 霉素心脏毒性的发生机制尚无统一的看法,但普便认为与过量氧自由基的产生有关。阿霉素的半醒结构能够引起线粒体呼吸链脱偶联,诱导自由基的大量产生,而组织抗氧化酶不足以清除过量的活性氧自由基,最终导致心肌组织损伤和细胞能量代谢紊乱。抑制氧自由基的产生,或者直接清除过量氧自由基,均有助于减轻阿霉素的心脏毒性。前者如目前唯一批准应用于临床的抗阿霉素心脏毒性保护剂右雷佐生,其主要作用机制是鳌合铁离子、抑制铁离子介导的氧自由基产生,从而发挥保护作用;后者以各种自由基清除剂为代表。三七总皂苷多属于达玛烷型三菇皂苷,其化学结构上并无清除自由基或鳌合金属离子的基团,也无相关活性的报道,因此其作用机制具有新颖性。实验结果表明,PNS干预的动物心肌组织各种抗氧化

酶的活力显著高于模型组,这说明PNS的心肌保护作用应该与此有关。但是较高的抗氧化酶活力水平是PNS抗阿另外 , Cat +超载也是阿霉素损伤的主要原因之一,研究表明阿霉素能破坏心肌细胞膜结构的完整,影响其通透性,诱发细胞外Cat‘的内流,同时还可能进一步刺激线粒体和肌浆网释放更多的ca2+ ,使胞内Ca2今 的浓度持续性上升,进而激活与之相关的信号途径,对心肌细胞产生损伤作用。鉴于以往对PNS在相关领域作用机制的研究中发现PNS存在调节一些细胞内Ca2十 浓度的作用[61,笔者推测PNS对心肌细胞的作用可能与其调节细胞内Ca,十水平有关。但其确切的机制还有待进一步研究探索


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